胡昊实验室揭示脑瘫的分子病因, 脑瘫其实是一种遗传病
原创 胡昊 逻辑神经科学 2021-7-1
撰文︱胡 昊
责编︱王思珍
脑性瘫痪（cerebral palsy），简称脑瘫，是指在婴幼儿脑发育早期，由于多种原因导致的非进行性脑损伤综合征，是一种婴幼儿中枢神经系统（CNS）早期发育异常造成的运动障碍以及姿势异常，可伴有智力障碍，癫痫，感知觉障碍，语言障碍，自闭症，或睡眠障碍等【1】。脑瘫可根据以下特征进行临床分类：运动体征（痉挛型、运动障碍型、共济失调型和肌张力减退型，其中约80%表现为痉挛型）、四肢受累情况（偏瘫、单瘫、双瘫、三肢瘫和四肢瘫痪）和脑部病变部位（大脑皮层、锥体束、锥体外系和小脑）【1-3】。脑瘫是引起儿童期身体残疾最普遍的原因之一，每1000名活产婴儿中的患病率为2.0-3.5例，全球有超过2000万患者。然而，在过去的50年中，足月儿脑瘫的发病率一直保持不变【1-6】。
脑瘫发病原因长期以来未能形成共识，传统认为脑瘫的高危因素为围产期和妊娠期的损伤，包括早产，新生儿缺氧，感染和致畸剂暴露等【1, 6】， 然而三分之二的脑瘫患儿均是足月出生，以往认为的新生儿缺氧仅能解释不到10%病例【2, 4, 5】。不明原因脑瘫患儿比例多达80%，因此，有理由推断绝大多数的脑瘫病例存在着某些未知的致病机制【3】。
近年来，越来越多的研究证据支持脑瘫的发生有遗传原因，包括家族性病例的报导和单卵双胞胎同时患病等，并且脑瘫发病率与父母年龄之间的正相关也表明存在遗传因素【7-11】。然而，通过评估多个脑瘫候选基因多态性的大规模病例对照研究，未能发现任何显著相关的变异【2, 12, 13】。因此提示，脑瘫的遗传基础可能与其他神经发育障碍的遗传基础相似，具有高度遗传异质性【14-16】。
迄今为止，关于脑瘫病因学的已知分子遗传学信息不足，这阻碍了精准医学时代脑瘫患者的预防、预后和治疗的改进。由于脑瘫的高度遗传异质性，需要招募大规模队列来完全破译相应的基因谱，并应解决地理和种族的差异性。致病机理认识上的模糊造成脑瘫的诊断和治疗长期处于缓慢发展状态，医学界和广大患者群体迫切期待脑瘫病因学的实质性突破。
近日，广州市妇女儿童医疗中心的科研团队在Brain上发表了一项针对于脑瘫病因学的长文研究，题目为In-depth analysis reveals complex molecular aetiology in a cohort of idiopathic cerebral palsy。该研究深入分析了特发性脑瘫队列的脑瘫复杂分子病因，阐明了脑瘫病因学的新方面，并为未来的治疗策略提供了见解。
该项研究历时五年，作者从临床收集来自120个家庭的122例特发性脑瘫病例入手，首先详尽调查其孟德尔遗传学病因和母系遗传学病因。结果发现，约有45%的脑瘫患者带有症状可解释的遗传变异，其中以生殖系错义点变异（germline missense SNVs）最为常见，其他类型生殖系变异包括无义点变异（nonsense SNVs）、插入缺失型变异（indels）和大片段拷贝数变异（CNVs）等均有检出。
很有意义的是，此发现首次揭示了体细胞自发突变（postzygotic mutations）在脑瘫分子病因学中占有一席之地，比例高达约6.7%，与其他神经发育性疾病如智力障碍（智障）和自闭症相似。就遗传模式而言，作者发现，常染色体显性和常染色体隐性各占已解决病例的三分之一，余下的是X染色体连锁和线粒体基因组变异。值得注意的是，脑瘫症状的严重程度与疾病相关变异的检出率呈正相关。另外，脑瘫并发智障患者群体的检出率也显著高于单纯型脑瘫患者群体。因此这些发现为将来开展脑瘫患者的临床遗传学筛查提供了一定的方向性指导。
瘫研究队列的临床信息和遗传背景
（图片来源：胡昊实验室）
接下来，作者汇总了该项研究鉴定的相关基因和以往文献报道的相关基因【17, 18】，并构建了114个脑瘫相关基因数据库。通过比较分析后发现，约有一半的脑瘫相关基因与智障相关基因重合，提示这两种疾病具有部分共通的分子机制。与智障相关基因相比，脑瘫相关基因的常染色体隐性遗传模式偏少，提示未来的脑瘫相关基因研究应当重点关注这一遗传模式。基因功能分析发现，脑瘫相关基因主要富集在与CNS发育密切相关的诸多模块里，很有意思的是，与病原微生物易感性有关的基因模块也出现富集，虽然这一证据尚不充分，但也暗示着脑瘫的发病可能与对部分病原体的易感性有关。基因表达分析发现，脑瘫相关基因主要表达在CNS控制意识和运动的各个脑区，尤其是小脑、初级运动皮层和纹状体，主要的细胞类型是浦肯野细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
作者还发现，脑瘫相关基因按照表达模式明显可以分为两类，约有一半基因集中在前脑区，其时序表达高峰在胚胎期，而另一半基因集中在后脑区，其时序表达高峰在出生后。特别有意思的是，带有第一种类型基因有害变异的脑瘫患者往往也是智障患者，而带有第二种类型基因有害变异的基本以单纯型脑瘫患者为主。这一发现首次创建脑瘫相关基因的二元分类学说，为脑瘫的分子病因学研究提供新的视角。基于这一学说，作者将两种类型脑瘫相关基因逐一梳理，分别挑出一个具有代表性的基因深入分析其分子机制，即TYW1基因和GPAM基因。
脑瘫相关基因的汇总分析（脑瘫：脑瘫，智障：ID）
（图片来源：胡昊实验室）
TYW1基因编码怀丁苷修饰酶，怀丁苷作为苯丙氨酸tRNAUUU上37位鸟苷酸的一种特殊修饰【19, 20】，对于稳定密码子-反密码子的准确配对，避免蛋白质翻译时出现移框现象具有重要作用【21-24】。然而，以往的文献未曾报道TYW1缺陷与人类疾病的关系。在此，作者从一个家庭的两个中重度脑瘫加智障患者的基因组中鉴定出了TYW1基因的复合杂合型有害变异，该患者严重小头畸形，蛛网膜下腔隙加宽，提示脑部发育不良。
斑马鱼模型中tyw1基因表达集中于脑和脊髓，当基因表达敲低（KD）以后，斑马鱼脑部各区域面积均出现显著减小，KD斑马鱼的运动时间、速度和距离也都显著下降，神经元的增殖和迁移也都下降；通过正常基因的回补实验则可以有效恢复表型，但带有脑瘫患者基因变异的回补实验则无效。
作者构建的小鼠模型也得到了类似结果。Tyw1基因敲除（KO）的小鼠脑部面积和重量都显著减小，水迷宫实验、抓力实验和转棒仪实验显示KO鼠的表现均出现显著下降。由此，作者推断TYW1基因缺陷确实是造成脑瘫患者临床症状的原因。
随后，为了阐明TYW1基因的具体作用机制，作者对小鼠模型开展了一系列的深入研究。首先，作者发现在小鼠和人类的脑部标本中，TYW1蛋白表达集中于各个脑区的神经元中。然后，E13.5和E15.5的EdU注射后的脑切片显色证明，Tyw1基因缺陷导致神经元增殖和迁移受阻；成年期小鼠脑切片免疫荧光染色证明，神经元迁移受阻的后果是大脑皮层浅层变薄而深层加厚，这一现象在额叶皮层和运动皮层均能观察到，与患者兼具脑瘫和智障两种症状相符。作者提取胚胎期小鼠大脑皮层原代神经元，通过EdU标记和TUNEL实验，证明胚胎期小鼠大脑神经元数量的减少是由于细胞增殖下降，而不是细胞凋亡上升。通过原代神经元的穿孔实验，作者再次证明胚胎期神经元的迁移能力确实表现出降低。
最后，作者针对TYW1基因作用原理构建数学模型用于评估人、小鼠和斑马鱼胚胎发育时期脑蛋白质组受到的影响。仿真计算显示，有四种蛋白质受到的影响最为显著，即CENPE、STIL、NCAPD2和SASS6，让人吃惊的是，这四种蛋白质都与细胞周期密切相关；其缺陷都会导致原发型小头畸形【25-35】。该结果得到QRT-PCR和WB实验验证。值得一提的是，Brain期刊审稿人高度评价这一机制研究，认为比通过一系列复杂组学实验来推测机制要更有逻辑性和说服力。
TYW1基因缺陷患者的临床表型和TYW1基因缺陷导致神经元增殖和迁移受阻的机制
（图片来源：胡昊实验室）
第二类基因的代表GPAM编码一种脂代谢的线粒体限速酶，对于脂质合成有重要影响，迄今未有其与人类疾病相关的报道【36】。作者从一个重度脑瘫患者的基因组中鉴定出了GPAM的复合杂合型有害变异，惊奇的是，该患者智商高达116，比三分之二的普通人群的智商要高。患者的脑部核磁共振常规扫描未现明显异常，但弥散张量成像（DTI）发现，脑白质尤其是皮质脊髓束发育不良，而这一结构是大脑运动皮层控制肢体运动的主要信息传导通道。
斑马鱼模型显示，gpam基因表达集中于正在发育中的脑部。当gpam KD后，斑马鱼脑部形态未有明显变化，而星形胶质细胞的数量和分布却出现明显异常，这种异常可由野生型gpam表达载体回补，而带有脑瘫患者基因变异的表达载体则无效。gpam KD后，斑马鱼的复杂运动（如顺时针/逆时针绕圈运动）频率显著增加，但是一般运动指标（如运动时间、速度和距离）均无明显变化。然而，该结果与前述tyw1 KD后的行为学结果完全相反，提示这两个基因的作用模式可能完全不同。
接下来，作者在构建的小鼠Gpam KO模型中未观察到脑部形态的明显异常，水迷宫实验结果也无显著差异，说明和人类一样，Gpam缺陷不会导致脑部结构的明显异常，也不会导致记忆和认知的问题。但是，Gpam KO的小鼠在转棒仪实验和抓力实验中均出现显著异常，说明缺陷主要体现在运动能力的下降。
在人类和小鼠的脑切片免疫荧光实验中发现，GPAM蛋白特异富集于星形胶质细胞。该基因KO后，部分脑区尤其是延髓中的星形胶质细胞显著减少，而各个脑区的神经元数量并未出现明显减少。通过对新生小鼠脑组织的流式细胞仪分析，作者发现，星形胶质细胞的数量减少主要是由于细胞复制效率的降低，而不是凋亡强度的上升。由此，作者得出了第一个结论：Gpam KO影响的主要是星形胶质细胞。
再接着，小鼠脑切片染色实验显示，运动皮层脑白质显著变薄，额叶皮层则不明显，而且，免疫荧光实验和WB实验均发现，髓鞘标志物Mbp在运动皮层和延髓明显减少，而延髓是皮质脊髓束的集中区域。由此，作者提出第二个结论：Gpam缺陷会导致皮质脊髓束的髓鞘发育不良。
那么，第一个结论和第二个结论有什么关系吗？有文献报道，条件性下调少突胶质细胞的脂质合成会导致急性脱髓鞘病【37】。众所周知，髓鞘是包裹在神经突触外的少突胶质细胞膜，其脂质含量远超一般细胞膜【38-41】。让人意外的是，这种脱髓鞘病一段时间后能自行缓解，说明有其他的脂质来源可以有效补给少突胶质细胞的脂质不足【37】。近几年的研究发现，星形胶质细胞是脑实质主要的脂质来源，不仅满足自身需求，还能大量提供脂质给神经元和少突胶质细胞【42-44】。由此，作者提出了潜在分子机制：GPAM基因在星形胶质细胞中参与脂质合成并输送给少突胶质细胞用于髓鞘形成，GPAM基因缺陷会造成持久的脱髓鞘病变，从而使皮质脊髓束功能受损。至于星形胶质细胞本身的增殖受阻，作者发现，是由于GPAM酶反应的下游产物PA参与星形胶质细胞的细胞周期调控，而这进一步会恶化星形胶质细胞的脂质合成和输送。
GPAM基因缺陷患者的临床表型和GPAM基因缺陷导致星形胶质细胞脂质代谢异常和髓鞘发育不良的机制（溶血磷脂酸：LPA，甘油-3-磷酸磷：G3P，脂酰肌醇：PI，磷脂酰胆碱：PC，磷脂酰乙醇胺：PE ，磷脂酰丝氨酸：PS）
（图片来源：胡昊实验室）
